药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)是临床上使用药物治疗疾病过程中一种常见的不良反应,主要表现为肝细胞死亡、肝功能损伤,甚至是急性肝衰竭。对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)是世界范围内使用最为广泛的一种抗热镇痛类药物。尽管APAP是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的非常安全的药物,但是APAP导致的肝损伤极其普遍,占药物性肝损伤的50%以上。APAP进入肝脏后,在细胞色素P4502E1(cytochrome P450, family 2, subfamily E, polypetide 1;CYP2E1)的催化下产生高活性有毒的中间代谢物N-乙酰-对-苯醌亚胺(N-acetyl-p-aminophenol,NAPQI)。正常情况下,NAPQI在谷胱甘肽(glutathione,GSH)作用下还原成无毒的硫醇和半胱氨酸产物。当APAP使用过量时,大量NAPQI导致肝细胞死亡,继而引发强烈的肝脏炎症反应,最终导致肝衰竭。因此,抑制过度激活的肝脏炎症反应被认为是治疗APAP诱导的药物性肝损伤的潜在靶点。

Kupffer细胞是肝脏常驻巨噬细胞,约占肝脏非实质细胞的20%,可识别大量内外源信号分子,启动肝脏炎症反应,在维持肝脏稳态方面发挥着至关重要的作用。Kupffer细胞在多种急慢性肝病中都发挥着重要作用,如急性病毒性肝炎、药物过量、缺血-再灌注(IR)、三氯乙烯(TCE)过敏综合征、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、酒精性肝病(ALD)等。然而,Kupffer细胞在APAP诱导的药物性肝损伤中的作用一直存在争议。早期Laskin等和Michael等使用氯化钆(gadolinium chloride,GdCl3)预处理大鼠和小鼠,显著降低了APAP肝毒性。后来的研究表明使用脂质体包裹的氯磷酸盐(clodrosome,CLO)预清除Kupffer细胞可能会加重肝损伤或没有影响。究其根本,这两种剔除Kupffer细胞的研究手段本身仍有争议。

Buch等通过将Cre转基因小鼠与含有可诱导的白喉毒素受体(diphtheria toxin receptor,DTR)转基因的小鼠杂交,首次实现白喉毒素(DT)介导的特定靶细胞清除。近年来利用Cre/iDTR系统实现细胞清除的例子比比皆是。例如,Demircik等利用该系统对CD19Cre/iDTR小鼠的B细胞进行了高效清除,Feng等利用该系统清除心肌细胞。最近,Zhao等将Cre酶和人DTR插入到Clec4f的基因序列后,建立了Clec4fCre/iDTR小鼠,实现了Kupffer细胞特异性剔除。本文利用该小鼠,探究特异性剔除Kupffer细胞在APAP诱导药物性肝损伤中的影响。

1.2 实验方法

1.2.1 急性肝损伤模型建立

使用8~10周、体重23~25 mg的C57BL/6J雄鼠,禁食18 h,随后腹腔注射300 mg/kg APAP或生理盐水,12 h后眼球取血并安乐死小鼠,取出肝脏用于后续试验。

1.2.2 Kupffer细胞清除

注射APAP前12 h对Clec4fCre/iDTR小鼠腹腔注射1 μg DT,至次日收样期间Kupffer细胞几乎全部剔除。

1.2.3 小鼠肝脏单个核细胞分离

采用两步胶原酶灌注法从小鼠肝脏中分离出单个核细胞。将小鼠麻醉后打开小鼠腹腔,暴露出肝脏的门静脉和下腔静脉。从门静脉插管,剪破下腔静脉,用预热灌洗缓冲液冲洗5 min后换成含0.08 % IV型胶原酶的消化灌洗液灌洗3 min,取出肝脏,将细胞释放,加入预冷终止液终止消化,4℃离心机50 g离心5 min,去除肝实质细胞,上清液在4℃离心机600 g离心10 min,沉淀用30% percoll重悬,4℃离心机800 g带刹车离心15 min后将沉淀转移至流式管,用预冷PBS清洗一次,裂解红细胞后用1 mL PBS重悬,取50 μL至流式管计数,100 μL至流式管标记抗体,上机检测Kupffer细胞的清除效率。

参考文献